毅硕Sentieon | 三代长读长分析助力遗传病检测：10× HiFi 数据如何助改善CYP21A2 变异检出？

在 [毅硕Sentieon | 三代长读长数据分析，助力罕见病与遗传病精准检测](https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzAwODMyNTEwMQ==&mid=2247508708&idx=1&sn=3dbf8a848f2d3a5974c40367086e67fc&scene=21#wechat_redirect) 中我们讨论了罕见病短读长 WGS 阴性后的分析入口选择，以及 Sentieon LongRead / Hybrid 在 GIAB 基准上的 SV 评测与运行效率。本篇我们将讨论一个更具体的结构性问题：对于存在高度同源假基因的 CYP21A2，加入 10× HiFi 数据后，Sentieon Hybrid 能否改善短读长的变异检出？

我们使用公开参考样本 HG002，对比短读长、长读长和 Hybrid 三种方案，并用 GIAB 基准核查结果。

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# 一、为什么选 CYP21A2

CYP21A2 是先天性肾上腺增生（CAH）最常见的致病基因，位于 chr6p21.33 的 RCCX 模块。它的特殊性在于紧邻一个序列高度相似的假基因 CYP21A1P。在 GRCh38 中，CYP21A2 位于 chr6:32,038,297–32,042,321，而 CYP21A1P 位于 chr6:32,005,689–32,008,399——两者相距约 30 kb，但编码序列同源性极高。短读长读段往往无法稳定区分来自真实基因和假基因的序列，部分高度同源片段难以唯一比对，可能影响特定位点的检出与基因归属判断。

这种定位困难有实际的临床后果。一项针对 832 例 21-羟化酶缺陷症患者的研究报告，在该研究所采用的短读长联合 MLPA 检测组合下，精确分子诊断率为 81.7%（680/832），剩余 144 例复杂嵌合变异和 8 例多拷贝变异未能通过该组合解决[1]。这个数字不应被泛化为“短读长的一般诊断上限”，该案例表明：在 CYP21A2 这类假基因/旁系同源区域，常规短读长流程确实存在系统性困难。传统上，该区域的致病变异常需 Sanger 测序或其他正交方法辅助确认。

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# 二、Hybrid 如何利用长读长

Sentieon DNAscope Hybrid 的设计逻辑为：分别用 BWA-MEM 比对短读长、用 minimap2 比对长读长；在短读长比对存在歧义的区域，利用长读长比对生成的单倍型作为框架，帮助短读长放置到更合理的位置，再进行联合变异检测。SV 由 DNAscope LongReadSV 模块基于长读长检出，CNV 由 CNVscope 基于短读长检出。

这一设计的依据在 Sentieon 团队发表的论文中有详细的描述。论文以患者 P10-B4 为例：一名 CAH 患者，致病变异是 CYP21A2 内含子 2 的一个剪接破坏性 SNP；由于 CYP21A1P 的高度同源性，短读长比对在该区域面临挑战；Hybrid 流程利用长读长组装的单倍型指导比对，使短读长能够准确映射，为该变异的识别提供支持[2]。

![图片](/media/202610/4dd7742f5d8e4cdab01b5b6611ebd2787016.png)

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# 三、测试设计：同一样本，三种方案

我们在本地使用 GIAB HG002 的 PacBio HiFi 35×长读长和 Illumina 35×短读长数据，其中从 PacBio HiFi 35× downsample 得到 PacBio HiFi 10×长读长数据，用于测试 Sentieon Hybrid 混测模式，同时运行纯短读长 DNAscope 和长读长单独分析作为对照。参考基因组版本为 GRCh38。比较基准采用 GIAB v4.2.1。

1. GIAB v4.2.1 SNP/Indel：https://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/ReferenceSamples/giab/release/AshkenazimTrio/HG002\_NA24385\_son/NISTv4.2.1/GRCh38/HG002\_GRCh38\_1\_22\_v4.2.1\_benchmark.vcf.gz

2. 基因组下载链接：https://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/ReferenceSamples/giab/release/references/GRCh38/GRCh38\_GIABv3\_no\_alt\_analysis\_set\_maskedGRC\_decoys\_MAP2K3\_KMT2C\_KCNJ18.fasta.gz

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# 四、结果查验

结果显示，三个关键位点均位于 GIAB v4.2.1 高置信区域内。

|位点（GRCh38）|GIAB 基准|短读长 35×|长读长 35×|Hybrid 35× + 10×|
|--|--|--|--|--|
|杂合 0/1|未报告|杂合，与基准一致|杂合，与基准一致|
|chr6:32041127 G>A|杂合 0/1|未报告|杂合，与基准一致|杂合，与基准一致|
|chr6:32041186 C>T|高置信区内无此变异|杂合 0/1，GQ=7|未报告 C>T|参考纯合 0/0，GQ=99|

在这三个差异位点上，Hybrid 与 35× 长读长方案均得到与基准一致的结果。两者都检出了短读长未报告的两个杂合 SNP，也都未报告短读长独有的 C>T。

## 1、IGV 截图查验

![图片](/media/202610/37e67f0bf10c4eec9a950a2361b393992585.png)

在 IGV 设置中不对 reads 做过滤，按 chr6:32041127 碱基排序（Sort alignments by -> base）。

![图片](/media/202610/431ee7e1f66c4dbb942e1c655ff514584661.png)

## 2、short35X.vcf.gz 结果查验

![图片](/media/202610/b09a538aa95646928ae1652e9454e8f87410.png)

## 3、long35X.vcf.gz 结果查验

![图片](/media/202610/7b63d7003f4a40faa932719aeef8de477133.png)

## 4、hybrid_short35X_long10X.vcf.gz 结果查验

![图片](/media/202610/79fdd8b3d3fc4d91b3d0e21f376ac39c8383.png)

## 5、GIAB 真值集结果查验

![图片](/media/202610/77bcb947e56e412f9d6598a935f4816e3925.png)

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# 五、对遗传病检测的启示

本次实测表明，在 HG002 的这些 CYP21A2 位点，35× 短读长补充 10× HiFi 后，使用 Sentieon Hybrid 进行分析，检出结果与 GIAB 基准更一致。

这为已有短读长数据、希望评估同源复杂区域检出表现的实验室，提供了一个可复核的混测实例。对于罕见病与遗传病分析，长读长的价值也包括补充已知基因中的检测证据。Sentieon Hybrid 提供了将这类证据与已有短读长数据联合利用的分析路径；本次 CYP21A2 对照展示了这一方案在具体位点上的改善。

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# 六、参考文献

1.  Wang R, et al. Long-Read Sequencing Solves Complex Structure of CYP21A2 in a Large 21-Hydroxylase Deficiency Cohort. _J Clin Endocrinol Metab_. 2025;110(2):406–416
    
2.  Hu J, Freed D, Feng H, Chen H, Li Z, Chen H. A novel and accelerated method for integrated alignment and variant calling from short and long reads. Frontiers in Bioinformatics. 2026;5:1691056. doi:10.3389/fbinf.2025.1691056.

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# Sentieon软件介绍

Sentieon为完整的纯软件基因变异检测二级分析方案，其分析流程完全忠于BWA、GATK、MuTect2、STAR、Minimap2、Fgbio、picard等金标准的数学模型。在匹配开源流程分析结果的前提下，大幅提升WGS、WES、Panel、UMI、ctDNA、RNA等测序数据的分析效率和检出精度，并匹配目前全部第二代、三代测序平台。

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Sentieon软件团队拥有丰富的软件开发及算法优化工程经验，致力于解决生物数据分析中的速度与准确度瓶颈，**为来自于分子诊断、药物研发、临床医疗、人群队列、动植物等多个领域的合作伙伴提供高效精准的软件解决方案，共同推动基因技术的发展。**

截至2026年4月份，Sentieon已经在全球范围内为1860+用户提供服务，用户处理超过7400+PB数据量，被世界一级影响因子刊物如NEJM、Cell、Nature等广泛引用，引用次数超过1900篇。此外，Sentieon连续数年摘得了Precision FDA、Dream Challenges等多个权威评比的桂冠，在业内获得广泛认可。