Sentieon发布核心家系（trio）基因分析最佳实践方案

# 一、背景介绍

在罕见病诊断中，单样本基因组/ 外显子组测序常面临 “瓶颈”—— 无法判断变异是否呈现家系共分离，漏检率高，致病变异筛选如同 “大海捞针”。而核心家系分析（先证者 + 生物学父母联合测序）恰好破解这一难题：若父母未患病，其基因组变异大概率与孩子病情无关，可大幅缩小候选致病变异范围。

研究数据印证了这一优势：进行核心家系分析的儿童，诊断率比单样本分析约高5 倍；平均仅向临床团队报告 1 个候选变异（单样本分析平均报告 2.5 个），“10万基因组计划” 也显示，核心家系检测的患者最易获得确诊结果。

Sentieon 的 DNAscope 流程基于预训练机器学习模型，已实现单样本分析准确度的大幅提升。如今，针对核心家系分析需求，Sentieon 推出专属流程，聚焦孟德尔错误（ME） 与新生突变（Denovo Mutation） 的精准识别，进一步降低假阳性、减少漏检，为临床诊断提供更可靠的数据支撑。

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# 二、适用场景

**研究对象**：疑似罕见病患者及其父母（核心家系）；

**数据类型**：全基因组测序（WGS）数据，支持 PCR-free 和 PCR 建库样本；

**核心目标**：判断变异的家系共分离模式；精准识别孟德尔错误位点；高效筛选对诊断至关重要的新生突变。

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## 1. 环境必备

- 软件授权：Sentieon license

- 软件下载：[https://ftp.insvast.com/user/Sentieon/release/arm-sentieon-genomics-202503.02.tar.gz](https://ftp.insvast.com/user/Sentieon/release/arm-sentieon-genomics-202503.02.tar.gz)

- 软件下载用户名：insvast；密码：Ins@1234；
- 模型下载：https://github.com/Sentieon/sentieon-models/

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## 2. 分析流程

该分析流程主要针对家系WGS 的数据，核心目标是准确识别先证者的 de novo 突变。流程通过 **“初步检测→联合调用→筛选孟德尔不兼容变异→重调用优化→二次联合调用”** 的步骤，逐步提高变异检测的准确性，最终输出高质量的家系变异结果，尤其是新突变的注释信息。

![](/media/202510/07622bc0ce6a4b8fa0a3d1686f8d54c32628.png#align=center)

该流程用于处理家系（trio，通常指先证者及其父母）全基因组测序数据的变异检测，使用Sentieon和bcftools进行分析。核心分析流程如下：

**步骤1：单样本变异检测**

使用DNAscope对家系每个样本进行变异检测，生成 GVCF。

```
# 先证者变异检测
sentieon-cli dnascope -r FASTA --r1-fastq P_FQ1 --r2-fastq P_FQ2 \
  --readgroups "@RG\tID:proband_name\tSM:proband_name\tPL:platform" \
  -m MODEL_BUNDLE -d dbsnp --duplicate-marking rmdup \
  --assay WGS --gvcf --skip-svs --skip-multiqc --pcr-free proband_name.vcf.gz
# 父亲/母亲变异检测（命令结构与先证者一致，仅样本名和输入文件不同）
sentieon-cli dnascope ... father_name.vcf.gz
sentieon-cli dnascope ... mother_name.vcf.gz
```

**步骤2：家系联合基因型进行初轮联合变异检测**

使用GVCFtyper合并三人GVCF生成初步联合VCF。

```
sentieon driver -r FASTA --algo GVCFtyper \
  -v proband_name.g.vcf.gz -v father_name.g.vcf.gz -v mother_name.g.vcf.gz \
  joint-call_pass1.vcf.gz
```

**步骤3： de novo 突变检测**

检测家系中的de novo 突变，添加DNM标签标记新发突变位点。

```
bcftools +trio-dnm2 -p proband_name,father_name,mother_name -X GRCh38 \
  -o trio-dnm2.output.vcf.gz -Oz --use-NAIVE joint-call_pass1.vcf.gz
```

**步骤4：变异位点分类**

对变异位点进行分类，筛选孟德尔兼容/ 不兼容变异。

```
# 筛选孟德尔不兼容变异（可能是DNM）
bcftools view -i "FMT/DNM[0]==1" trio-dnm2.output.vcf.gz | \
  sentieon util vcfconvert - mendelian-incompatible.vcf.gz 
# 筛选孟德尔兼容变异（符合遗传规律）
bcftools view -e "FMT/DNM[0]==1" trio-dnm2.output.vcf.gz | \
  sentieon util vcfconvert - mendelian-compatible.vcf.gz
```

**步骤5：重召回孟德尔不兼容变异**

```
sentieon driver -r FASTA \
  -i proband_name_deduped.cram -i father_name_deduped.cram -i mother_name_deduped.cram \
  --algo DNAscope --pcr_indel_modelnone --given mendelian-incompatible.vcf.gz \
  --model MODEL_BUNDLE/dnascope.model mendelian-incompatible.recalled.vcf.gz
```

**步骤6：筛选高置信度重召回结果**

```
bcftools view -e "QUAL<qual_thresh" mendelian-incompatible.recalled.vcf.gz | \
  sentieon util vcfconvert - mendelian-incompatible.recalled.highconf.vcf.gz 
```

**步骤7：合并结果并进行第二次联合调用**

```
bcftools concat --allow-overlaps mendelian-compatible.vcf.gz \
  mendelian-incompatible.recalled.highconf.vcf.gz | \
  bcftools sort - | sentieon util vcfconvert - joint-call_pass2.vcf.gz
```

**步骤8：第二次检测 de novo 突变并建立索引**

```
bcftools +trio-dnm2 -p proband_name,father_name,mother_name -X GRCh38 \
  -o trio-dnm2.joint-call_pass2.vcf.gz -Oz --use-NAIVE joint-call_pass2.vcf.gz
sentieon util vcfindex trio-dnm2.joint-call_pass2.vcf.gz
```

**参数说明**

- `FASTA`：参考基因组 FASTA 文件路径，需与比对阶段使用的参考一致（如hg38的hs38.fa）；
  
- `dbsnp`：dbSNP 数据库 VCF 文件路径，用于变异注释（如hg38的dbsnp138版本）；

- `MODEL_BUNDLE`：DNAscope 预训练模型路径，需使用与数据平台匹配的模型（如Illumina WGS 的2.0 版本）；
- `--readgroups`：读组信息，需包含 ID（Read Group ID，读组ID）、SM（样本名）、PL（测序平台，如Illumina）；
- `--duplicate-marking`：PCR重复标记与处理，rmdup为去除重复，none为不处理（预处理阶段建议rmdup）；
  
**结果说明**

triodnm2.joint-call_pass2.vcf.gz是整个家系（trio）变异检测流程的核心输出文件之一，专门用于存储经过二次优化后筛选出的de novo 突变（DNM，即先证者中出现、父母均未携带的新突变）信息。该文件遵循 VCF标准格式，是基因组变异数据的通用存储格式。其中家系 DNM 相关注释如下：

1. ##FORMAT=<ID=DNM,Number=1,Type=Integer,Description="De novo mutation status (1=de novo, 0=not de novo, .=unknown)">：关键字段，标记该变异是否为 DNM（1 表示是 DNM）。
   
3. ##INFO=<ID=TRIO_STATUS,Number=1,Type=String,Description="Relationship status in trio (e.g., mendelian_compatible, de_novo)">：描述变异在家系中的遗传状态（如 “de_novo” 表示符合 DNM 特征）。

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# 三、DNAscope 核心家系设计优势

Sentieon 核心家系流程的准确性依赖以下核心设计：

1. **双轮迭代策略**：PASS 1 通过联合调用筛选候选 ME 位点，PASS 2 通过多样本共比对（co-alignment）重新召回，修正单样本漏检导致的假阳性；
   
3. **真集训练与验证**：模型训练与流程验证采用 HG002 T2T（端到端）基因组真集及泛基因组样本，确保对复杂区域变异的准确识别；
4. **样本适配性**：同时支持 PCR-free 与 PCR 建库样本，通过动态参数调整（如--pcr-free、qual_thresh）适配不同实验条件。

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# 四、分析流程评测

为检测流程的准确率，我们分析了瓶中基因组核⼼家系标准品HG002、HG003、HG004的30 x Illmina WGS的PCR-free建库数据集。将检测得到的结果和真集中的ME进行比较，计算准确率。几乎不存在漏检，假阳性也被控制在⼀个合理的区间，如下图所示：

![](/media/202510/927b26607e154925b570f52660aeb0399168.png#align=center)

<center>SNP与INDEL变异检测的准确性评估</center>

- TP（真阳性）：在样本最终MElist中被列出，同时也存在于真集的MElist 。
  
- FN（假阴性）：存在于真集中但不在样本的最终MElist，表明该位点在先证者数据中被漏检或者错检。
- FP（假阳性）：存在于样本的最终MElist 但是不在真集中，表明该位点在先证者数据中就是假阳性或者在父母样本中漏检。

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