毅硕Sentieon | 人类（Homo sapiens）全基因组WGS分析流程

*今天给大家介绍的是基于 Sentieon 软件开发的用于人类（ Homo sapiens）全基因组测序数据的自动化流程脚本。该流程实现了从原始测序数据（FASTQ）到变异检测结果（GVCF）以及joint calling的完整分析流程，支持多个测序平台和输出格式。*

*脚本支持原始测序数据（rawfastq）、过滤后的测序数据（cleanfastq），进行质控、比对、排序、标记重复、生成质量评估指标，最终通过Haplotyper 算法进行变异检测，输出 gVCF 文件。*

*测试 人类样本平均测序深度26.3X，从FastQ到VCF全流程分析最快用时34.38分钟，大幅压缩了动物群体基因组分析时间，加快科研成果转化。*

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# 1.  环境设置与参数解析
## 1.1  Sentieon环境配置

**下载地址**

软件地址链接
- https://ftp.insvast.com/user/Sentieon/release/sentieon-genomics-202503.03.tar.gz （适配X86架构CPU服务器，例如Intel､ AMD､ 曙光）

- https://ftp.insvast.com/user/Sentieon/release/arm-sentieon-genomics-202503.03.tar.gz
 （适配ARM架构CPU服务器， 例如华为鲲鹏､ Ampare、阿⾥倚天）
- **注意**：安装包下载链接用户名：insvast；密码：Ins@1234

模型下载链接
- https://github.com/Sentieon/sentieon-models

[**环境设置变量[点击跳转阅读]**](http://doc.insvast.com/doc/11/)

## 1.2  变量定义与参数解析

```
#!/bin/bash
echo $0 \$SAMPLEID \$WORKDIR \$FASTQ_1 \$FASTQ_2 \$FASTA \$SUFFIX \$DATATYPE \$KEEP_CLEAN \$KEEP_BAM \$PLOIDY
set -euxo pipefail
```

`echo`：打印脚本名及输入参数占位符，方便调试时确认参数顺序。

`set -euxo pipefail`：设置脚本执行规则，增强健壮性。

```
export SAMPLEID=$1
export WORKDIR=$2
export FASTQ_1=$3
export FASTQ_2=$4
export FASTA=$5
BSUFFIX=$6
TYPE=${7:-"raw"}
KEEP_CLEAN=${8:-keep}
KEEP_BAM=${9:-keep}
PLOIDY=${10:-2}
LOGFILE=$SAMPLEID.run.log
export root=/Path/sentieon/202503/sentieon-genomics-202503/bin/
```

从命令行读取参数，包括样本 ID、工作目录、输入文件路径等。

部分参数设置默认值。

`LOGFILE`：定义日志文件名（样本 ID+.run.log）。

`root`：sentieon工具（基因组分析软件）的安装路径。

更详细的参数表格，如下表所示：

|  | 参数 | 含义 | 默认值 |
| --- | --- | --- | --- |
|$1 |SAMPLEID |样本ID |    |
|$2 |WORKDIR | 工作目录 | |
|$3 |FASTQ_1|FASTQ R1文件 |  |
|$4 |FASTQ_2 |FASTQ R2文件 |  |
|$5 |FASTA|参考基因组  fasta 文件 | |
|$6 |BSUFFIX |输出格式：bam/cram/空格 |无默认 |
|$7 |TYPE |数据类型："raw" 或 "clean" |"raw" |
|$8 |KEEP_CLEAN |是否保留质控后的 fastq |"keep" |
|$9 |KEEP_BAM  |是否保留去重后的 bam/cram |"keep" |
|$10 |PLOIDY |样本倍性（根据实际调整 |2 |

## 1.3  输入文件有效性检查

```
if [ "$BSUFFIX" = "bam" ] || [ "$BSUFFIX" = "cram" ] || [ "$BSUFFIX" = " " ]; then
    echo "$BSUFFIX check"
else
    die "Error: check 6th blank, BSUFFIX must be 'bam' or 'cram' or space"
fi
```

检查BSUFFIX，只能是bam（二进制比对格式）、cram（压缩比对格式）或空格，否则报错退出。

## 1.4  测序平台判断

```
if [ -e $LOGFILE ];then
    export PLATFORM=$(awk '/Platform/{print $NF;exit}'$LOGFILE)
else
    export count=$(zcat $FASTQ_1|head -n 1|awk '{print NF}')
    if [ $count -eq 1 ];then
        export PLATFORM="DNBSEQ"
    elif [ $count == 2 ];then
        export PLATFORM="ILLUMINA"
    elif [ $count == 3 ];then
        export PLATFORM="ILLUMINA"
    else
        echo"Unrecognized platform"
        export PLATFORM="ILLUMINA"
    fi
fi
```

若日志文件已存在，从日志中提取测序平台（Platform字段）。

若日志不存在，通过 FASTQ 文件首行的字段数判断平台。

## 1.5  输出文件格式确定

```
FAI=$FASTA.fai
if [ "$BSUFFIX" = "bam" ] || [ "$BSUFFIX" = "cram" ];then
export SUFFIX=$(awk -v preset=$BSUFFIX 'BEGIN{max=0}{if($2>max)max=$2}END{if(max>536870911){print "cram"}else{print preset}}' $FAI)
else
export SUFFIX=$(awk 'BEGIN{max=0}{if($2>max)max=$2}END{if(max>536870911){print "cram"}else{print "bam"}}' $FAI)
fi
```

根据参考基因组索引文件（$FASTA.fai）中最长序列的长度决定输出比对文件格式：
- 若最长序列长度 > 536870911（约 512MB），强制使用cram（更适合大基因组压缩）。
  
- 否则根据BSUFFIX或默认bam。

补充说明：对于单个染色体长度>536870911（约512MB）的物种（比如小麦），Sentieon软件可以切换至cram，不用因BAM 文件索引 (.bai) 的格式限制切割染色体。

## 1.6  环境与目录配置

```
export TMPDIR=$WORKDIR
export THREADS=$(nproc)
[ -e $WORKDIR ]||mkdir -p $WORKDIR
cd $WORKDIR
exec >>$LOGFILE 2>&1
echo "SampleID:" $SAMPLEID
echo "DataType:" $TYPE
……
```

配置临时目录、线程数，确保工作目录存在，并将所有输出写入日志文件。

## 1.7  设置计时函数(可选)

```
timer(){
    start_time=$(date +%s)
    eval $2 && touch $3
    end_time=$(date +%s)
    cost_time=$[ $end_time-$start_time ]
    echo -e "TIMER: $1\t$(($cost_time/60)) min $(($cost_time%60)) s"
}
```

用于记录每个分析步骤的开始/结束时间、耗时，并通过创建标记文件（如qc.ok）标记步骤完成，避免重复执行。

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# 2.  数据质控（Raw2clean）

- 双端测序质控脚本：

```
raw2clean(){
    cmd="fastp -w 16 -i $FASTQ_1 -I $FASTQ_2 -o $clean1 -O $clean2 -j $SAMPLEID.qc.json -h $SAMPLEID.qc.html&&rm $FASTQ_1 $FASTQ_2"
    timer raw2clean "$cmd" qc.ok
}
```

- 单端测序质控脚本：

```
raw2clean(){  
    cmd="fastp -w 16 -i $FASTQ\_1 -o $clean1 -j $SAMPLEID.qc.json -h $SAMPLEID.qc.html&&rm $FASTQ\_1"  
    timer raw2clean "$cmd" qc.ok  
}
```

使用fastp工具对原始 FASTQ 数据进行质控（过滤低质量reads、接头等），输出过滤后的 FASTQ 文件及质控报告文件（JSON/HTML）。

成功后创建qc.ok标记文件。

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# 3.  序列比对与排序（Alignment）
- 双端测序比对脚本：

```
alignment(){
    tag="@RG\tID:rg_$SAMPLEID\tSM:$SAMPLEID\tPL:$PLATFORM"
    cmd="sentieon bwa mem -R \"$tag\" -t $THREADS -K 10000000 -x $ML_MODEL/bwa.model $FASTA $clean1 $clean2|sentieon util sort --temp_dir $TMPDIR -r $FASTA -o $SAMPLEID.sorted.$SUFFIX -t $THREADS --sam2bam -i -"
    echo $cmd
    timer alignment "$cmd" align.ok
}
```

- 单端测序比对脚本：

```
alignment(){
    tag="@RG\tID:rg_$SAMPLEID\tSM:$SAMPLEID\tPL:$PLATFORM"
    cmd="$root/sentieon bwa mem -R \"$tag\" -t $THREADS -K 10000000 $FASTA -x $ML_MODEL/bwa.model $clean1 |$root/sentieon util sort --temp_dir $TMPDIR -r $FASTA -o $SAMPLEID.sorted.$SUFFIX -t $THREADS --sam2bam -i -"
    echo $cmd
    timer alignment "$cmd" align.ok
}
```

使用sentieon bwa turbo进行序列比对（基于BWA算法），添加Read Group信息（用于后续变异分析），并通过sentieon util sort对结果排序，输出sorted.bam或sorted.cram。

基于测序平台选择不同的机器学习模型（$ML_MODEL）优化比对。

成功后创建align.ok标记文件。

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# 4.  生成质量评估指标（Metrics）

```
metrics(){
    cmd="sentieon driver --temp_dir $TMPDIR -r $FASTA -t $THREADS -i $SAMPLEID.sorted.$SUFFIX --algo WgsMetricsAlgo $SAMPLEID.WGS_METRICS.txt --algo MeanQualityByCycle $SAMPLEID.mq_metrics.txt --algo QualDistribution $SAMPLEID.qd_metrics.txt --algo GCBias --summary $SAMPLEID.gc_summary.txt $SAMPLEID.gc_metrics.txt --algo AlignmentStat $SAMPLEID.aln_metrics.txt --algo BaseDistributionByCycle $SAMPLEID.bd_metrics.txt --algo QualityYield $SAMPLEID.qy_metrics.txt --algo InsertSizeMetricAlgo $SAMPLEID.is_metrics.txt"
    timer metrics "$cmd" metrics.ok
}
```

使用sentieon driver计算多种测序质量指标，包括：

- 全基因组测序指标（WgsMetricsAlgo）。
  
- 碱基质量分布、GC 偏差、插入片段长度等。

结果输出到多个质量指标的.txt文件，成功后创建metrics.ok。

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# 5.  标记重复序列（Dedup）

```
dedup(){
    cmd="sentieon driver -r $FASTA --temp_dir $TMPDIR -t $THREADS -i $SAMPLEID.sorted.$SUFFIX --algo LocusCollector --fun score_info $SAMPLEID.score.txt&&sentieon driver -r $FASTA -t $THREADS -i $SAMPLEID.sorted.$SUFFIX --algo Dedup --score_info $SAMPLEID.score.txt --metrics $SAMPLEID.dedup_metrics.txt $SAMPLEID.deduped.$SUFFIX&&rm $SAMPLEID.sorted.$SUFFIX* $SAMPLEID.score.txt*"
    timer markdup "$cmd" markdup.ok
}
```

标记重复序列分两步：

- `LocusCollector`：收集位点质量分数信息。
 
- `Dedup`：基于分数标记并去除 PCR 重复序列。
  
完成后删除中间文件（排序后的比对文件），创建markdup.ok。

# 6.  碱基质量重校正(BQSR可选)

```
bqsr(){
    sentieon driver -t $THREADS -r $FASTA -i $SAMPLEID.deduped.$SUFFIX --algo QualCal -k $KNOWN_SITES $SAMPLEID.RECAL_DATA.TABLE
    sentieon driver -t $THREADS -r $FASTA -i $SAMPLEID.deduped.$SUFFIX -q $SAMPLEID.RECAL_DATA.TABLE --algo QualCal -k $KNOWN_SITES $SAMPLEID.RECAL_DATA.TABLE.POST --algo ReadWriter $SAMPLEID.deduped.RECALIBRATED.$SUFFIX
    timer markdup "$cmd" markdup.ok
}
```

- 此过程分为两个主要部分：首先创建一个校正模型（生成 .TABLE 文件），然后应用该模型生成报告和碱基质量重校正后的bam。
- `--algo QualCal`: 指定运行的算法是 QualCal（质量校正算法）。
  
- `KNOWN_SITES`：已知变异数据库的VCF文件路径。
- `RECAL_DATA.TABLE`：重校准表的位置和文件名。
- `RECAL_DATA.TABLE.POST`: 临时性的后重校准表的位置和文件名。
- `--algo ReadWriter`：这一步为可选的。Sentieon® 变异检测可以在运行时使用校正前的 BAM 加上重校准表来即时执行重校正。便可以不输出巨大的BAM文件，节省磁盘的空间。
- 若选择执行这一步，第七部分变异检测中请将`$SAMPLEID.deduped.RECALIBRATED.$SUFFIX`设为输入文件。
  
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# 7.  变异检测（DNAseq）

```
dnaseq(){
    cmd="sentieon driver --temp_dir $TMPDIR -r $FASTA -t $THREADS -i $SAMPLEID.deduped.$SUFFIX --algo Haplotyper --emit_conf=30 --call_conf=30 --emit_mode gvcf --ploidy $PLOIDY $SAMPLEID.hc.gvcf.gz && md5sum $SAMPLEID.hc.gvcf.gz > $SAMPLEID.hc.gvcf.gz.md5"
    timer Haplotyper "$cmd" hc.ok
}
```

使用Haplotyper算法进行单倍型分析，生成 GVCF 文件。

计算 GVCF 文件的 MD5 ，确保文件完整性，成功后创建hc.ok。

# 8.  Joint Calling
## 8.1  参数检查与使用说明

```
#!/bin/bash
[ $# -eq 0 ]&&echo Usage: $(basename $0) \$FASTA \$GVCF_LIST  \$NUM \$DATADIR&&exit
start_time=$(date +%s)
```

如果脚本没有传入任何参数，则打印使用说明并退出。

使用方式：脚本名 FASTA文件 GVCF列表文件 NUM 数据目录

记录脚本开始执行的时间

## 8.2  设置错误处理

```
set -euo pipefail
```

`-e`: 任何命令失败则退出脚本。

`-u`: 使用未定义的变量时报错。

`-o pipefail`: 管道中任何一个命令失败则整个管道失败。

## 8.3  参数赋值

```
DATADIR=$4
FASTA=$1 #"$FASTA_DIR/genomeEN_split.fa"
GVCF_LIST=$2
NUM=$3
```

`$1`: 参考基因组 FASTA 文件路径。

`$2`: 包含所有样本 GVCF 文件路径的列表文件。

`$3`: 用于命名输出文件的数字标识（如批次号）。

`$4`: 数据目录，用于存放输出文件。

## 8.4  设置线程数、工作目录和日志文件

```
NT=$(nproc) #number of threads to use in computation, set to number of cores in the server
WORKDIR="$DATADIR/JointCall-${NUM}"
[ -e $WORKDIR ]||mkdir -p $WORKDIR
#[ -e $file ]&&exit 0
cd $WORKDIR
LOGFILE=$WORKDIR/joint-call${NUM}_run.log
exec >$LOGFILE 2>&1
```

`NT`: 获取当前系统的 CPU 核心数。

`WORKDIR`: 根据 NUM 创建唯一的工作目录。

将所有标准输出和标准错误重定向到日志文件。

## 8.5  执行联合变异检测

```
root=/APP/u22/x86_com/sentieon/202503/sentieon-genomics-202503
cat $GVCF_LIST|$root/bin/sentieon driver -r $FASTA  --algo GVCFtyper   \
      $WORKDIR/output${NUM}-jc.vcf.gz - || { echo echo "GVCFtyper failed"; exit 1; }
```

`cat $GVCF_LIST`: 读取 GVCF 文件列表。

`sentieon driver`: 调用 Sentieon 驱动程序。

`-r $FASTA`: 指定参考基因组。

`--algo GVCFtyper`: 使用 GVCFtyper 算法进行联合变异检测。

`output${NUM}-jc.vcf.gz`: 输出的压缩 VCF 文件。

如果命令失败，输出错误信息并退出。

## 8.6  计算并输出运行时间（可选）

```
end_time=$(date +%s)
cost_time=$[ $end_time-$start_time ]
echo "joint calling time is $(($cost_time/60))min $(($cost_time%60))s"
echo "the Joint-calling done at `date +%H:%M:%S` !!!"
```

计算脚本运行的总时间，并以“分:秒”格式输出。最后输出完成时间。

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# 9.  总结
该脚本实现了DNA测序数据从原始测序数据（FASTQ）到变异检测结果（GVCF）以及joint calling的完整分析流程，支持Illumina/DNBSEQ平台，可配置输出格式（BAM/CRAM）和中间文件保留策略，通过标记文件和日志确保流程可进行追溯，适用于大规模基因组变异检测场景。特点包括：

- **参数化**：通过命令行参数灵活控制输入、输出和流程选项。
  
- **自动化**：自动检测测序平台和参考基因组以决定最佳分析策略。
- **稳健性**：使用 set -euxo pipefail和标记文件实现错误处理和断点续跑。
- **模块化**：将每个分析步骤封装成函数。
- **高效性**：使用商业优化的sentieon工具替代金标准GATK/BWA，速度更快。
- **可追溯性**：详细的日志记录和 MD5 校验确保结果可重现。

要运行此脚本，需要预先安装好 sentieon、fastp等软件，并准备好对应的模型文件 bundle。

[具体脚本请点击阅读](https://github.com/Sentieon/sentieon-scripts/blob/master/example_pipelines/germline/DNAseq/wgs.sh)

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# 10.  脚本应用示例
使用上述脚本对人类全基因组测序数据分析的测序结果，具体样本信息如下表所示：

| 类别 | 详情|
| --- | --- |
| 物种id| Homo sapiens | 
| 物种名和倍性|人类 (二倍体)| |
|参考基因组|GCF_000001405.26_GRCh38_genomic.fna|
|参考基因组大小（Gb）|3.1|
|测试数据来源|GIAB HG001 downsample|
|测序平台|Illumina HiSeq|
|系统版本|Ubuntu 24.04/Kernel 6.8|
|cpu型号|AmpereOne A192-32X|
|sentieon版本|sentieon-genomics-202503|
|raw_reads|551809652|
|raw_data（Gb）|81.67|
|测序深度（X）|26.3|

**测序数据下载：**

可以从GIAB官方链接下载：

https://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/giab/ftp/data/NA12878/NIST_NA12878_HG001_HiSeq_300x/

本次测试中的数据为该项目中部分fq数据合并得到。

**参考基因组下载：**

方法一：
```
wget -c
https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/001/405/GCF_000001405.26_GRCh38/GCF_000001405.26_GRCh38_genomic.fna.gz
```
方法二：
```
curl -C - -0 --progress-bar 
https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/001/405/GCF_000001405.26_GRCh38/GCF_000001405.26_GRCh38_genomic.fna.gz
```

**解压**

```
gunzip GCF_000001405.26_GRCh38_genomic.fna.gz
```

- 测试硬件配置
    - CPU为单颗AmpereOne A192-32X
      
  - 内存为512GB DDR5
  - 系统为Ubuntu 24.04/Kernel 6.8

- 测试结果

使用本文流程对人类全基因组测序数据进行变异检测分析，下表为不同CPU核数下的计算时间和资源调用情况:

| | 128核 | 96核 | 64核 | 32核 | 16核 |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
|比对时间（min）|33.80 |26.46 |34.00 |57.19 |147.86 |
|比对内存峰值（GB）|63.54 |65.21 |74.68 |78.90 |85.91 |
|度量指标内存时间（min）|0.68 |0.73 |1.00 |1.46 |3.55 |
|度量指标内存（GB）|6.22 |5.86 |5.13 |4.05 |2.45 |
|去重时间（min）|1.20 |1.30 |1.25 |2.53 |4.46 |
|去重内存（GB）|19.88 |14.97 |7.51 |3.30 |2.82 |
|变异检测时间（min）|4.51 |5.89 |8.96 |15.53 |39.34 |
|变异检测（GB）|19.75 |13.08 |10.34 |5.81 |3.79 |
|总时间（min）|40.19 |34.38 |45.21 |76.71 |195.21 |

本次测试在不同的线程数上进行性能的比较。从数据中可以明显看出，随着线程数的增加，变异检测的整体效率显著提升。从FastQ到VCF全流程分析最快用时34.38分钟，大幅压缩了动物群体基因组分析时间，加快科研成果转化。

Sentieon在不断的优化算法的运行效率，为科研工作者提供更快速、更经济的基因检测方案。若您刚好有需要检测的数据，不妨来申请试用Sentieon吧！